Остеопластические материалы нового поколения НПО «ПОЛИСТОМ», в которых как компоненты использована композиция факторов роста, депонируемых костной тканью, и антиоксидант; они обладают высокими остеоиндуцирующими свойствами, вызывают умеренную реакцию со стороны окружающих тканей, нецитотоксичны и могут быть рекомендованы к использованию для остеопластики в отоларингологии.

Construction materials for regeneration of bone in otorhinolaryngology

Osteoplastic materials of the new generation of SPA «POLYSTOM» in which the components of the used composition of growth factors deposited with the bone tissue, and antioxidant; they have high osteoinduction properties, cause mild reactions from the surrounding tissues, is not cytotoxic and can be recommended for use for osteoplasty in otolaryngology.

Введение. Проблема возмещения костных дефектов ЛОР органов — врожденных, посттравматических или постоперационных — является актуальной. Около 12 лет назад в отоларингологии с этой целью стали применяться остеопластические материалы, создаваемые в НПО «ПОЛИСТОМ» [1-3]. Они были использованы при радикальных операциях по поводу хронического гнойного эпитимпанита для уменьшения послеоперационной полости, при перфоративном одонтогенном гайморите с целью закрытия свищевого хода, для пластики стенок околоносовых пазух и носовой перегородки, облитерации лобных пазух и других вмешательствах на ЛОР-органах. С их применением были прооперированы несколько сотен больных с высоким клиническим эффектом. В НПО «ПОЛИСТОМ» непрерывно проводятся разработки по дальнейшему совершенствованию остеопластических материалов, основные направления которых приводятся в настоящем сообщении.

Цель и задачи этих разработок прежде преследуют:

1. Повышение остеоиндуцирующих свойств, что делает возможным их использование при операциях у больных со сниженным регенерационным потенциалом — при остеопатиях и остеопорозе инволюционной, эндокринной, алиментарной, ятрогеной природы.

2. Оптимизация реакции окружающих тканей при имплантации остеопластического материала в костный дефект — снижение активности асептического воспаления, оксидативного стресса.

3. Устранение цитотоксичности остеопластических материалов, что необходимо для использования их при создании клеточно-тканевых инженерных конструкций — наиболее перспективного направления регенерационной медицины.

Результаты и обсуждение

Повышение остеоиндуцирующих свойств новых остеопластических материалов достигнуто путем включения в них композиции водорастворимых белков костной ткани неколлагеновой природы (НБК), имеющих электрофоретическую подвижность в области α1- и α2-глобулинов, аффинных к коллагену и ортофосфатам кальция [4]. Эта композиция НБК, содержащая, как установлено, ряд морфогенетических белков костной ткани и местных факторов роста — трансформирующего фактора роста-ß, инсулинподобных факторов роста, факторов роста фибробластов и др. [5-7] дозозависимо влияет на пролиферацию и дифференцировку клеток мезенхимального происхождения.

Дозозависимость действия композиции НБК на физиологическую активность предшественниц остеогенных клеток нами была исследована на культуре фибробластов из свода черепа эмбрионов коров с двойной радиоактивной меткой: ³Н-тимидин — маркер синтеза ДНК и ¹⁴С-триптофан — маркер экспрессии неколлагеновых белков. Было показано, что композиция факторов роста из костной ткани, добавленная в кондиционную среду, при низких концентрациях стимулирует клеточную пролиферацию, при высоких — дифференцировку и экспрессию генов дифференцированных клеток [8].

Недавно эксперимент был продолжен с использованием первичной культуры фибробластов, полученных из кожно-мышечной ткани 13-дневных эмбрионов мышей линии C57BL/6-Tg(ACTbEGFP)1Osb/J. Для испытания выбран раствор композиции НБК крупного рогатого скота, осветленный и стерилизованный ультрафильтрацией, с исходной концентрацией ~500 мг/л. После 20-дневного культивирования в среде, содержащей дексаметазон и разведения НБК (1:100, 1:1000, 1:10000), клетки были окрашены 2%-ным раствором ализаринового красного для выявления образования минерализованного матрикса по степени окрашивания соединений кальция и определения активности щелочной фосфатазы (ЩФ, КФ 3.1.3.1.) по Mc Gadey. Среда, содержащая композицию НБК в разведении 1:100, показала наибольшую активность в стимуляции жизненной активности клеток. На 20-й день культивирования видны центры кальцификации, количество которых существенно больше, чем в аналогичной культуре с добавлением основного фактора роста фибробластов (контроль). В культивированных клетках обнаружена высокая активность ЩФ. Морфология клеток в центрах кальцификации соответствует фенотипу остеобластов.

Эти эксперименты показали, что композиция НБК способна повышать остеогенные потенции тканеинженерных конструкций, предназначаемых для возмещения костных дефектов, и в НПО «ПОЛИСТОМ» была разработана серия новых остеопластических материалов «Индост» (патент РФ № 2317088) [9]. Апробацию нового материала проводили в экс­периментах по возмещению дефектов костей у лаборатор­ных животных (крыс линии Вистар) при соблюдении норм содержания, вмешательства и выведения из опыта. На этапах экспериментов проводили морфологические исследования новообразованной ткани в месте имплантации испытуемого материала. Свидетельства остеогенной дифференцировки в виде сети молодых костных балок были выявлены не позже чем через две недели после создания дефекта и заполнения его остеопластическим материалом, тогда как в кон­троле, как правило, дефект был заполнен хрящевой тканью (рис. 1).

Рис. 1. 14-е сутки возмещения костного дефекта материалом ИНДОСТ

К концу срока наблюдения (60-75 сут.) дефект в опыте был заполнен костной тканью, завершившей ремоделирование (рис. 2). Материалы новой серии прошли все регламентные испытания и разрешены к клиническому применению.

Рис. 2. 75-е сутки возмещения костного дефекта материалом ИНДОСТ

Включение композиции НБК в остеопластический материал отчасти решает и вторую из поставленных задач. В эксперименте по субдермальной имплантации крысам декальцинированного костного внеклеточного матрикса (КВМ) мы установили, что предварительное инкубирование его в растворе, содержащем такую композицию, существенным образом влияет на состав воспалительного клеточного вала, окружающего частицы имплантированного материала. В случае имплантации «реставрированного» КВМ значительно уменьшается доля нативных и деградирующих лимфоцитов и увеличивается количество фибробластоподобных клеток (р<0,01).

Другим решением для выполнения этой задачи было добавление в остеопластические материалы антиоксидантов. Окислительный стресс, с неизбежностью сопровождающий хирургическое вмешательство, является причиной асептического воспаления, отека, деструкции окружающих имплантат тканей, апоптозом и некрозом клеточных элементов — источника последующей репарации. В развитии этих процессов важную роль играют продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ), несущие свободные радикалы. В эксперименте на лабораторных животных апробированы антиоксидантные свойства композиции коллаген-ортофосфат, в состав которой введен дигидрокверцетин в концентрации 20 мг/г. В группе сравнения использовали идентичный материал, не содержащий антиоксиданта. В качестве экспериментальной модели использовали субдермальную имплантацию остеопластических материалов 12 крысам. На 3-и, 7-е и 14-е сутки после имплантации в крови животных определяли уровни продуктов ПОЛ: диеновых и триеновых конъюгатов (ДК и ТК), малонового диальдегида (МДА) и оснований Шиффа (ОШ) в полярной и неполярной фазах гексан-изопропанольного экстракта сыворотки крови, Результаты определения приведены в таблице 1. Различия для опытной группы заключаются: а) в меньшем общем количестве продуктов ПОЛ в крови; б) в меньшей степени их перекисного окисления: изменения в опыте, главным образом, во фракциях ДК и ТК, в контроле — во фракциях МДА и ОШ; в) интактности неполярных липидов в условиях оксидативного стресса. Морфологические отличия в группе, где имплантат содержал антиоксидант, наиболее существенными были на первых двух этапах и заключались в меньшей степени активности асептического воспаления и менее интенсивном инкапсулировании имплантата. Можно считать, что менее была выражена реакция окружающих тканей на имплантат как на инородное тело.

Таблица 1.

Изменения содержания продуктов ПОЛ в цельной крови крыс через 3 суток после имплантации остеопластического материала

Группа  животных	Неполярная фаза			Полярная фаза
	ДК	КТ	ШО	ДК	КТ	ШО
Интактные крысы	0,259 ±0,041	0,105 ±0,015	0,046 ±0,005	0,106 ±0,012	0,011 ±0,002	0,024 ±0,003
Коллаген-ГАП	0,332* ±0,040	0,163* ±0,013	0,049 ±0,005	0,130* ±0,010	0,043* ±0,003	0,018 ±0,002
Коллаген-ГАП +АО	0,241 ±0,027	0.084* ±0,012	0,042 ±0,004	0,178* ±0,016	0,025* ±0,002	0,013* ±0,001

ДК — диеновые конъюгаты, КТ — кетотриены, ШО — Шиффовы основания

^* результаты, отличающиеся с уровнем <0,05 по критерию U (Вилкоксона – Манна – Уитни) от таковых в группе «интактные крысы»

Исследования цитотоксичности остеопластических материалов после проводили с использованием первичной культуры фибробластов человека, которые были выделены из кожно-мышечной ткани эмбриона на сроке 6 недель. Клетки культивировали в среде ДМЕМ с добавлением 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) и 100 Ед/мл пенициллин/стрептомицина в атмосфере 5% СO₂. По 100 мкл водной вытяжки из ИНДОСТа помещали в лунки 24-луночного планшета для культивирования клеток, в которые перед этим на сутки были высеяны клетки (плотность посева 35 тыс./см², среда ДМЕМ с 10% ЭТС), и добавляли 400 мкл среды ДМЕМ без сыворотки. Для проведения данного исследования применили стандартный МТТ тест. В качестве контролей при проведении МТТ теста были использованы равные количества физиологического раствора. Результаты испытаний позволили считать, что все образцы исследованных материалов не содержат водорастворимых компонентов, отрицательно влияющих на жизнеспособность клеток, напротив, водная вытяжка из них имеет тенденцию повышения последней (рис. 3).

Рис. 3. Эмбриональные фибробласт после 24 ч культивирования в присутствии вытяжки из ИНДОСТа

Показателями жизнеспособности клеток являются адгезивность, сохранение характерных морфологических признаков, способности к распластыванию и амебеоидному движению на поверхности материала. Исследование адгезии клеток к поверхности остеопластических материалов ИНДОСТ было проведено через 2 часа после посева клеток в среде ДМЕМ без сыворотки. Образцы материалов были помещены в лунки 24-луночного планшета для культивирования клеток и залиты 500 мкл среды ДМЕМ, клетки высевали на поверхности образцов с плотностью 160 тыс./см² и культивировали в течение 2 часов. Для визуализации клеток и оценки их жизнеспособности использовали метод окрашивания 0.0002%-ным раствором акридинового оранжевого в фосфатном буфере. Оба материала являются адгезивными для клеток, при этом клетки распластываются на плотной поверхности материала ИНДОСТ-пластина (рис. 4).

Рис. 4. Распластывание эмбриональных фибробластов на поверхности пластины ИНДОСТа

Таким образом, остеопластические материалы нового поколения НПО «ПОЛИСТОМ», в которых как компоненты использованы композиция факторов роста, депонируемых костной тканью, и антиоксидант, обладают высокими остеоиндуцирующими свойствами, вызывают умеренную реакцию со стороны окружающих тканей, нецитотоксичны и могут быть рекомендованы к использованию для остеопластики в отоларингологии.

 

К.С. Десятниченко, С.Г. Курдюмов, Е.В. Истранова, И.И. Селезнева, А.И. Лебедева

Научно-производственное объединение «ПОЛИСТОМ» (Москва)

 

Литература:

1. Анютин Р.Г., Курдюмов С.Г. Применение гидроксиапола и колапола в отолярингологии // М., 1998. — Материалы 8-й научно-практ. конф. — С. 17-18.

2. Николаев Н.П. Хирургическая облитерация биокерамикой лобных пазух при травматических повреждениях и хронических рецидивирующих фронтитах // М., 2000. — Мат. 9-й научно-практ. конф. — С. 31-33.

3. Николаев Н.П. с соавт. Мастоидопластика биокомпозиционными материалами при операциях у больных с хроническим средним отитом // М., 2002. — Мат. 10-й научно-практ. конф. — С. 91-93.

4. Воложин А.И., Курдюмов С.Г., Орловский В.П. и др. Научные основы создания нового поколения биосовместимых материалов на основе фосфатов кальция для широкого применения в медицинской практике // Технология живых систем. — 2005. — Т. 1. — № 1. — С. 41-56.

5. Canalis E. Bone-relatedgrowh factors // Triangle., 1988. — Vol. 23. — P. 11-19.

6. Fincelman R.D. Growth factors in bones and teeth // CDA J. — 1992 — Vol. 20. — N 12. — P. 23-29.

7. Goldring M.B. Goldring S.R. Sceleta1 tissue response to cytokines // Clin. Orthop., 1994. — N 258. — P. 245-278.

8. Десятниченко К.С., Ковинька М.А., Талашова И.А. О перспективах применения остеоиндуцирующих материалов для возмещения дефектов костей // Новые технологии в медицине. — Матер. конф. c междунар. участием (Курган, 19.09.2000 г.). — Курган, 2000. — Ч. 1. — С. 75-76.

9. Десятниченко К.С., Курдюмов С.Г., Леонтьев В.К. Пути повышения активности, стимулирующей репаративный остеогенез, у материалов, имплантируемых в костный дефект // Стоматолог-практик, 2006. — № 5. — С. 143-145.