Проведено изучение   микровезикуляционного механизма гемостаза в патогенезе  аномальных маточных кровотечений (АМК) пубертатного периода для оптимизации диагностики степени тяжести и эффективности лечебных мероприятий. Выявлены  разнонаправленные изменения,  отражающие гетерогенность патологии: адаптивная реакция в виде повышения системного и локального образования микровезикул при более кратковременной и дезадаптивная — при продолжительной  кровопотере.  Установлена  связь тяжести заболевания с изменением процесса микровезикуляции у больных АМК. Отсутствие нормализации уровня микровезикул является прогностически неблагоприятным  признаком, свидетельствующим о малой эффективности гормонотерапии.

В пубертатном периоде аномальные маточные кровотечения (АМК), как правило, рассматриваются как связанные с гормональной дисфункцией и изменением структуры эндометрия. Частота их в структуре гинекологической заболеваемости колеблется от 10% до 37,5% [7]. Однако более чем в 50% случаев патогенез заболевания остается невыясненным, что обуславливает невозможность использования унифицированной схемы лечения [8,1]. Известные механизмы маточных кровотечений включают нарушение контрактильной активности матки, снижение тонуса маточных артерий вследствие нарушения баланса вазоконстрикторных и вазодилататорных простагландинов, нарушение регенерации эндометрия и патологию тромбообразования, особенно в тромбоцитарно-сосудистом звене, а также в результате активации фибринолитической системы [4,12]. Вне зависимости от механизмов, инициирующих аномальное кровотечение, значимость гемостатических реакций, обеспечивающих тромбообразование на уровне эндометрия, признается единодушно, поскольку их адекватность предотвращает патологические последствия кровопотери и вторичные органические изменения в эндометрии.

Отсутствие комплексных критериев качества проводимой терапии маточных кровотечений пубертатного периода затрудняет принятие индивидуального решения при выборе тактики ведения данной категории пациенток. При продолжительных и рецидивирующих АМК система гемостаза нередко оказывается недостаточной или исчерпанной, приводя к снижению адаптивных возможностей подросткового организма и обуславливая тем самым малую эффективность проводимой терапии [6].

В последние годы возрос интерес исследователей к изучению различных методов диагностики АМК, позволяющих определять не только патогенез заболевания, но и оценивать степень тяжести процесса и проводить динамический контроль адекватности назначения терапии [3,2]. Доказана роль функционального состояния клеточного звена гемостаза в контроле эффективности методов лечения [2].

В последнее десятилетие был окончательно установлен субклеточный компонент гемостатического процесса — клеточные микровезикулы (М) — носители фосфатидилсерина (ФС) для сборки теназного и протромбиназного комплексов свертывающей системы крови, тканевого фактора.  Микровезикулы отделяются при активации и апоптозе эндотелия кровеносных сосудов и клеток крови и способствуют усилению прокоагулянтного эффекта в ходе инициации свертывания крови. Немногочисленные исследования микровезикуляции при гипокоагулемических состояниях свидетельствуют о том, что повышенное содержание микровезикул отражает мобилизацию гемостаза, направленную на активацию тромбинообразования и, таким образом, может быть проявлением адаптивных изменений в организме при кровоточивости [10,12,11].

Учитывая, что наиболее часто  дисфункция системы гемостаза реализуется в подростковом периоде у девочек с началом менструаций, представляется актуальным определение роли М в патогенезе аномальных маточных кровотечений периода пубертата, а также оценке эффективности лечебных стратегий по результатам исследования динамики количественных и качественных характеристик М.

Целью настоящего исследования явилось изучение состоятельности микровезикуляционного механизма гемостаза в патогенезе  аномальных маточных кровотечений пубертатного периода для оптимизации диагностики степени тяжести и эффективности лечебных мероприятий.

Материал и методы

В основу работы положены результаты ретро- и проспективного исследования 147 пациенток с АМК периода пубертата. Изучены данные анамнеза и объективного исследования.

В ходе обследования при ретроспективном анализе выявлены 2 больные с тромбоцитопатией в анамнезе и 2 девочки с гипоталамическим нейроэндокринным синдромом; проспективно обнаружены дефекты системы гемостаза (n=6) в виде идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, болезни Виллебранда, тромбоцитопатии; синдром поликистозных яичников (n=2) и первичный гипотиреоз (n=2), что явилось основанием для их исключения из группы собственного исследования.

Проспективную группу составили 47 пациенток с АМК периода пубертата. Средний возраст больных — 14,10+0,23 лет. Количество и прокоагулянтный фенотип М в периферической и маточной крови исследовали при поступлении в стационар в момент кровотечения до начала лечения, а также в ходе терапии на фоне негормонального и гормонального (по стандартной гемостатической схеме) методов остановки кровотечения и спустя 1 мес.

Формирование подгрупп осуществлялось по исходной оценке тяжести течения заболевания, контролю эффективности лечебных мероприятий, а также в зависимости от количественных и качественных характеристик микровезикул (М) крови. Подгруппу I составили 23 пациентки (49%) с легким  или умеренным течением заболевания и выявленным исходно высоким уровнем М периферической крови, у которых остановка кровотечения произошла на фоне проведения симптоматической терапии 1-м этапом (транексам, дицинон, окситоцин, аскорбиновая кислота, свечи с ибупрофеном); подгруппу II — 17 больных (36,2%) с объективно более тяжелым геморрагическим синдромом и  низкими значениями М в периферической крови в момент поступления, гемостаз у которых достигнут приемом низкодозированных монофазных комбинированных оральных контрацептивов (КОК) с содержанием этинилэстрадиола 30 мкг  (марвелон, регулон) 2-м этапом лечения; в подгруппу III определены 7 девочек (14,9%) c рецидивирущим течением заболевания и зарегистрированным повышенным экспонированием фосфатидилсерина (ФС) тромбоцитами и М периферической и маточной крови.

Контрольная  группа  —  10 здоровых девушек-подростков,  средний возраст которых составил 14,50+0,62 лет; критерием включения являлись нормальная менструальная функция, отсутствие анамнестических, клинических и лабораторных признаков коагуляционных расстройств. Исследовалась периферическая кровь в 1, 5-6, 14-15, 26-27 дни менструального цикла и менструальная кровь в 1-й день месячных.

Микровезикуляция клеток крови исследовалась методом проточной цитометрии на приборе FACS Calibur (Becton Dickinson). Стабилизированная цитратом кровь центрифугировалась 15 минут при 130g для получения обогащенной тромбоцитами плазмы и 1500 g для выделения бесклеточной плазмы, содержащей микровезикулы. Абсолютное количество М в 1 мкл определяли по светорассеиванию за фиксированное время (60 секунд) с использованием программы Cell Quest. Нарушение асимметрии клеточной мембраны оценивалась окрашиванием клеток и микровезикул флуорохромом мероцианином 540 (МС540) (Sigma). Регистрация клеток и М с повышенной интенсивностью флуоресценции выявляет изменения упаковки мембранных фосфолипидов при их перемешивании (scrambling) и совпадает с экспрессией ФС при ее выявлении аннексином V. Регистрацию результатов осуществляли на втором детекторе FL2 цитометра.

Результаты исследования и их обсуждение

Результаты ретроспективного анализа свидетельствуют о недооценке клиницистами важности диагностического поиска гемостатических дефектов при планировании терапевтических мероприятий этой категории больных. Гематологический анамнез собран лишь в 3,2% случаев, несмотря на наличие меноррагий  и  первой менструации в виде кровоточивости. Исследованные показатели гемостаза при диагностике АМК в стационаре включали: количество тромбоцитов; время свертывания по Сухареву, по Ли-Уайту; ПТИ; концентрация фибриногена (по Рутберг); АЧТВ (лишь в 6% случаев). Выявленные изменения: тромбоцитопения (2,2%); замедление времени свертывания по Ли-Уайту (1,1%); гипофибриногенемия (2,2%). Это позволяет сделать вывод о необходимости гематологической настороженности при ведении пациенток с кровоточивостью и расширения объема диагностики скрытых дефектов системы гемостаза.

Анализ эффективности методов гемостатической терапии показал наибольшую частоту рецидивирования АМК после применения КОК (рис.1).

Определение количества М  в периферической и маточной крови в течение нормального менструального цикла в контрольной группе (n=10) выявило следующую динамику: в 1-2-й дни — 87830,0±13495,07/мкл, 5-6-й дни — тенденция к снижению (61943,25±860,34/мкл; р>0,05), достигавшее статистической значимости к середине цикла (49860,0±3012,42/мкл; р<0,05), возрастание к 26-27 дню цикла (140065,0±38802,51/мкл; р<0,05). Уровень микровезикул в менструальной жидкости в среднем трехкратно превышал уровень в периферической крови (248625,0±31079,57/мкл; р<0,01).

Анализ результатов обследования девочек-подростков с АМК показал, что их значения микровезикуляции клеток крови отличаются от аналогичных показателей у здоровых девушек. Выявлен достоверно более высокий уровень М (146057,75+14946,87; р<0,05) в периферической крови пациенток, у которых остановка кровотечения была достигнута негормональными средствами (подгруппа I), и низкий (47840,45±8054,60; р<0,001) — у больных,  гемостаз которых произошел на фоне применения КОК (подгруппа II) (рис.2).

Уровень М  в маточной крови у больных I подгруппы был достоверно выше (905742,78+246848,27; р<0,001), чем в контрольной группе, во II подгруппе разница не достигала статистической значимости (588513,75+238609,80; р>0,05).

После остановки кровотечения выявлено снижение количества М в периферической крови на фоне негормональной терапии у пациенток I подгруппы (82218,89+14610,44; р<0,01). Важно отметить, что, несмотря на клинически полную остановку кровотечения при использовании  КОК,  обнаружена лишь тенденция к повышению уровня М во II подгруппе (83446,67±23447,09; р>0,05) (рис.2). И именно у этой категории больных наблюдались повторные АМК.

Значение интенсивности микровезикуляции для эффективной остановки кровотечения нашло подтверждение в  выявленной обратной корреляционной связи (r=-0,2; p<0,05) длительности кровотечения с уровнем М и прямой взаимозависимости (r=0,44; p<0,05) тяжести анемии (уровня гемоглобина) и количества М. Статистически значимая прямая взаимосвязь уровня М и концентрации  фибриногена (r=0,8; p<0,01) при длительном кровотечении у больных II подгруппы может быть отражением потребления компонентов коагуляции. Выявлена положительная прямая корреляция между уровнем М и уровнем гонадотропинов — ЛГ (r=0,67; p<0,05) и ФСГ (r=0,65; p<0,05), что свидетельствует о гормон-зависимой активации клеток. Интересен факт обнаружения обратной статистически значимой взаимосвязи количества М и выраженности гиперпластических изменений  эндометрия по результатам эхографии  (r=-0,91; p<0,01) у больных II подгруппы, что согласуется с данными Фединой Е.В., доказавшей, что более чем у половины больных с гиперпластическими процессами  имеет место нарушение реакции отторжения эндометрия, обусловленное дисфункцией системы гемостаза [9].

Анализ уровня экспонирования ФС микровезикулами и тромбоцитами показал существенные отличия у больных с рецидивирующими АМК (подгруппа III), как  по сравнению со значениями при  однократных эпизодах АМК (подгруппы I и II), так и в контрольной группе. У большинства пациенток (78,7%) в общей популяции обследуемых экспрессия ФС на тромбоцитах (0,28±0,05%) и М (0,22±0,06%) периферической крови соответствовала уровню здоровых подростков (0,36±0,09% и 0,28±0,05%, соответственно, р<0,05; n=47), однако в маточной крови содержание ФС на тромбоцитах (0,25±0,22%) и М (0,15±0,01%) явилось достоверно ниже контроля (4,81±0,16% и 1,05±0,11%, р<0,01; n=47). Этот факт можно расценивать как патогенетический фактор кровопотери, поскольку такие тромбоциты и М несут более низкий прокоагулянтный потенциал.

В то же время у больных с рецидивирующими АМК (подгруппа III), выявлена достоверно более высокая, по сравнению с контролем и при однократном эпизоде АМК, экспрессия ФС на тромбоцитах  и М, и в периферической, и в маточной крови (рис.3).

Анализ фосфолипидного состава тромбоцитов и М при повторном эпизоде кровотечения выявил нарастание экспонирования ФС микровезикулами, как в периферической, так и маточной крови (рис.4), что свидетельствует о персистенции прокоагулянтных частиц, потенциально способных поддерживать внутрисосудистое свертывание крови. Об этом свидетельствуют и выявленные признаки гиперкоагулемии (повышение уровня РКФМ до  6,08±0,74*10^-2 г/л) у пациенток III подгруппы.

Выявлена прямая корреляционная связь уровня ЛГ и ФСГ со степенью экспонирования ФС микровезикулами (r=0,12 и r=0,42, p<0,05, соответственно) и тромбоцитами (r=0,17 и r=0,34, p<0,05, соответственно), как в периферической, так и в маточной крови у больных III подгруппы (гипогонадотропный тип  АМК). Можно полагать, что сдвиги гормонального фона при ановуляторном менструальном цикле являются одним из факторов, оказывающих в данном случае активирующее влияние на тромбоциты, являясь дополнительным индуктором повышенного отделения М на фоне постгеморрагической гиперкоагулемии.  По данным В.И. Тимошенского с соавторами (1977), которые провели комплексное исследование взаимосвязи рецидивирующих носовых и маточных кровотечений, рассматривая вопрос о существовании так называемых викарных или конкомитирующих кровотечений, нередко функциональные способности (гипо- и гиперактивность) тромбоцитов частично обусловлены гормональной дисфункцией яичников [13,5].

Таким образом, исследование микровезикуляции клеток крови как маркера прокоагулянтных сдвигов, сопровождающих аномальное маточное кровотечение, выявило разнонаправленные изменения,  отражающие гетерогенность патологии. Адаптивная реакция в виде повышения системного и локального образования микровезикул при более кратковременной кровопотере и дезадаптивная — при продолжительной, наряду с установленной корреляционной зависимостью тяжести заболевания с изменением процесса микровезикуляции у больных АМК, имеет высокую диагностическую и прогностическую значимость при выборе тактики их ведения.

Прогностически неблагоприятными признаком, свидетельствующим о малой эффективности гормонотерапии, несмотря на временную остановку кровотечения, является отсутствие нормализации уровня микровезикул, что свидетельствует о снижении функциональной потенции гемостатического ответа и высокой вероятности повторных длительных кровотечений, что требует своевременной замены препарата. Пониженная локальная активация тромбоцитов и образование М с низким экспонированием ФС может рассматриваться как патогенетический фактор геморрагии.  Часть пациенток, проявляющая более выраженную системную и локальную реакцию тромбоцитов и устойчивое образование М с повышенным экспонированием фосфатидилсерина, являются группой риска коагулопатии потребления.

Список сокращений:

АМК      аномальное маточное кровотечение

АЧТВ     активированное частичное тромбопластиновое время

КОК       комбинированные оральные контрацептивы

М            микровезикулы

МС540   мероцианин 540

ПТИ       протромбиновый индекс

РКФМ    растворимые комплексы фибрин-мономеров

ФС          фосфатидилсерин

Ф.В. Валеева,   Л.Д. Зубаирова,   А.А.Тагирова

Казанская государственная медицинская академия

Казанский государственный медицинский университет

ГУ «Межрегиональный клинико-диагностический центр» МЗ РТ

Литература:

1.  Гуркин Ю.А. Гинекология детей и подростков / Ю.А. Гуркин, И.Н. Гоготадзе. — СПб.: Мед. информ. агентство, 1998 — 345 с.

2.  Диагностическое применение компьютерной морфометрии тромбоцитов при маточных кровотечениях у подростков / Лободина И.М. [и др.] // Проблемы репродукции. — 2008. — Т.14, №3. — С. 43-47

3.  Коколина В.Ф. Детская и подростковая гинекология: руководство для врачей / В.Ф. Коколина. — М.: Медпрактика-М, 2006.  — 640 с.

4. Саидова Р. А. Избранные лекции по гинекологии: учеб. пособие для студентов мед. вузов /  Р. А. Саидова, А. Д. Макацария. — М.: Триада-X, 2005. — 256 с.

5. Тимошенский В. И. О генезе и взаимосвязи рецидивирующих носовых и маточных кровотечений / В. И. Тимошенский, З. С. Баркаган, Г. Н. Перфильева // Вестник отоларинголога. — 1977. — №2. — С. 78-82

6. Уварова Е.В. Клиническое значение применения препарата Транексам для остановки маточного кровотечения в пубертатном периоде / Е.В. Уварова, И.М. Лободина, Н.М. Веселова // Репродуктивное здоровье детей и подростков. — 2008. — №1. — С.9

7. Уварова Е.В., Веселова Н.М., И.М. Лободина. Патомимические нарушения при маточных кровотечениях у подростков/ Репродуктивное здоровье детей и подростков. 2006.- №5. — С.55

8. Уилсон П. Гинекологические заболевания: справочник / П. Уилсон; под ред. В. Н. Прилепской. — М.: МЕДпресс-информ, 2002. — 56 с.

9. Федина Е. В. Значение исследования системы гемостаза для выбора тактики ведения больных репродуктивного периода с гиперпластическими процессами эндометрия: автореф. дис. …канд. мед. наук / Е. В. Федина; Моск. мед. акад. им. И.М.Сеченова. —  М., 2007. — 26 с.

10. Circulating microparticles as a marker of recombinant activated FVIII (NovoSeven) efficacy in patients with FVIII or FIX inhibitors / V. Proulle [et al.]  // Thromb Haemost. — 2001. — Vol. 86(7). — P. 345-347.

11. Horstman L.L. Clinical significance of platelet microparticles in autoimmune thrombocytopenias / L.L. Horstman, M. Arce, Y.S.   Ahn // J. Lab. Clin. Med. — 1992. — Vol. 119(6) — P. 334-345.

12. Interaction of P-selectin and PSGL-1 generates microparticles that correct hemostasis in a mouse model of hemophilia A / I. Hrachovinová [et al.] // Nat. Med. — 2003. —  Vol. 9(8). — P. 1020-1025.

13. Platelet functional defects in women with unexplained menorrhagia / C.S. Philipp [et al.] // J. Thromb. Haemost. — 2003. —  Vol. 1(3). — P. 477-484

14. Preanalytical conditions that affect coagulation testing, including hormonal status and therapy / M. Blombäck [et al.] // Journal of Thrombosis and Haemostasis. — 2007. — Vol.5 (4). —  P. 855 — 858.