В работе исследовано влияние низкомолекулярного хитозана на музейный и клинический штаммы гриба Candida albicans. Показано, что хитозан вызывает различные изменения в строении клеточной стенки у исследуемых штаммов.

Введение

На протяжении всей жизни человек постоянно сталкивается с представителями грибного царства. Иногда такое взаимодействие приводит к нежелательным последствиям в виде грибковых заболеваний, микотоксикозов, аллергических реакций. Для борьбы с грибами успешно используются многочисленные антимикотики и фунгициды. Однако, разработка новых форм препаратов сохраняет свою актуальность и в настоящее время из-за появления резистентных штаммов микроорганизмов, а также все возрастающих требований по безопасности к противогрибковым веществам.

Одним из таких веществ является хитозан — биогенный полимер, получаемый из хитина методом щелочного деацетилирования и состоящий из остатков глюкозамина и ацетилглюкозамина [1]. Биоцидной активности хитозана посвящено большое количество экспериментальных работ [2, 3]. При этом, проявляя ингибирующее действие в отношении мицелиальных и дрожжеподобных грибов, хитозан оказывает меньшее влияние на клетки млекопитающих [4]. Тем не менее, механизмы противогрибкового действия этого биополимера на клеточном и молекулярном уровнях раскрыты неполностью. Важность изучения противогрибковой активности хитозана связана также с все более широким использованием этого полимера в качестве биомедицинских материалов и как компонента косметических средств [1]. Остается до конца невыясненной взаимосвязь между химической структурой хитозанового полимера и его биологическим эффектом на клетки микроорганизмов. Установление подобной взаимосвязи осложняется тем, что хитозан, являющийся гетерополимером, представляет собой разнородную группу веществ, различающихся по молекулярной массе, степени ацетилирования, расположению ацетилированных звеньев вдоль полимерной цепи, вязкости, значению рКа [5, 6]. Поэтому для исследования биологической активности хитозана необходимо использовать хитозановые образцы с охарактеризованным молекулярно-массовым распределением и известной химической структурой [7, 8].

Цель работы — определение концентрационной зависимости действия низкомолекулярного узкодисперсного хитозана на музейный и клинический штаммы Candida albicans и выявление, вызываемых хитозановым полимером, морфологических изменений в грибных клетках.

Материалы и методы

В работе использовали производственный штамм Candida albicans №4 из музея КНИИЭМ, а также клинический изолят, выделенный от больного с выраженным кандидозом. Клинический штамм обладал устойчивостью к дифлюкану, низоралу, флуконазолу, брунгалу, итраконазолу, клотримазолу, пимафуцину, был слабочувствителен к амфотерицину, ламизилу, нистатину. Штаммы грибов поддерживались на агаризованной среде Сабуро.

В работе использовали низкомолекулярный гидрохлорид хитозана, полученный с помощью кислотной деполимеризации. Степень деацетилирования хитозана ≥99,9%. Средневесовая молекулярная масса (Mw) 8,3 кДа, индекс полидисперсности (Ip) 1,5. Средневесовую молекулярную массу и значение полидисперсности хитозана определяли методом гель-проникающей ВЭЖХ на приборе «Sykam» (Германия) c использованием тандема колонок Ultrahydrogel 250 и Ultrahydrogel 500 (Waters, США). Контроль и обсчет хроматографии осуществляли с помощью программы «Мультихром» версия 1.6 (ЗАО «Амперсенд», Москва). Растворы хитозана стерилизовали посредством фильтрации через мембраны с диаметром пор 0,22 мкм.

Противогрибковое действие хитозана исследовали в жидкой среде Сабуро при рН 5,5-5,7. Для этого в среду добавляли раствор хитозана до необходимой конечной концентрации. Затем вносили свежеприготовленную суспензию грибов в той же среде до конечной концентрации 105 КОЕ/мл. После 48 ч инкубации при 30°С оценивали рост культуры и проводили микроскопический анализ.

Результаты

Было показано, что хитозан в концентрациях 25, 50 и 100 мкг/мл не ингибировал рост культур обоих штаммов грибов. Однако при проведении микроскопии культуры музейного штамма Candida albicans отмечено утолщение клеточных стенок, наблюдались изменения во внутреннем строении клеток — количество вакуолей увеличивалось, ядро становилось плохо различимым, нарушалось расхождение клеток после почкования, из-за чего образовывались крупные клеточные скопления.

В концентрации 200 мкг/мл рост культуры музейного штамма Candida albicans не наблюдался. Микроскопический анализ выявил наличие небольшого количества живых клеток, которые практически все имели угловатую, вытянутую или иную неправильную форму (рис. 1). Некоторые из них имели размер, превышающий нормальный в два-три раза, возможно, из-за нарушения регуляции осмотического баланса или нерасхождения ядерного материала в ходе размножения. У некоторых живых клеток с нарушенной целостностью клеточной стенки наблюдалось вытекание цитоплазматического содержимого в среду. В самой среде находилось большое количество материала от погибших клеток, который, благодаря агглютинирующим свойствам хитозана, образовывал различного размера конгломераты (рис. 1).

Рис. 1. Действие хитозана на клетки музейного штамма Candida albicans. А — без хитозана; Б, В, Г — хитозан 25-100 мкг/мл; ц — цитоплазма; км — клеточный материал

Практически не влиял на рост культуры клинического штамма Candida albicans хитозан даже в концентрации 500 мкг/мл. Однако по сравнению с контрольным вариантом без хитозана клетки не образовывали ростовые трубки и псевдомицелий (рис. 2).

Рис. 2. Действие хитозана на клетки клинического штамма Candida albicans. А — без хитозана; Б — хитозан 500 мкг/мл; п — псевдомицелий; т — ростовые трубки

Обсуждение

Исходя из полученных нами экспериментальных данных, следует, что музейный и клинический штаммы Candida albicans обладают различной чувствительностью к низкомолекулярному хитозану. В присутствии хитозана клетки музейного штамма гриба в отличие от клинического изолята подвергаются существенным морфологическим изменениям, а при повышении концентрации полимера в среде погибают. Морфология клеток клинического изолята гриба остается практически неизменной, а сами клетки продолжают размножаться даже в присутствии той концентрации хитозана, при которой не растет музейная культура. Однако клинический штамм перестает образовывать ростовые трубки и псевдомицелий, которые являются одними из важнейших показателей его высокой вирулентности [9].

Очевидно, что несмотря на разницу в чувствительности музейного и клинического штаммов Candida albicans, хитозан затрагивает важные физиологические процессы, протекающие в клетках обоих культур микроорганизмов. Как видно из рисунка 1, под действием хитозана изменяется форма клеток, которая, как известно, определяется, прежде всего, состоянием клеточной стенки. У отдельных клеток наблюдается выход цитоплазматического содержимого через поврежденные внешние клеточные структуры. Вероятно, клеточная стенка кандиды становится первым объектом действия для хитозана. Это подтверждается и тем, что действие полимера на клетки другого гриба Saccharomyces cerevisiae одним из первых активизирует группы генов, которые участвуют в биогенезе клеточной стенки и поддержании ее нормальной структуры, например, гены, кодирующие 1,3-β-глюкансинтетаза и белки, участвующие в гликозилировании маннопротеинов клеточной стенки, а также имеющие отношение к ЦПМ [10]. Таким образом, действие хитозана приводит к изменению экспрессии тех генов, которые имеют отношение к структурам-мишеням для хитозанового полимера, каковыми являются клеточная стенка и ЦПМ, а также ЭПР, в котором образуются составные компоненты для поверхностных структур [10]. Возможно, нарушения, происходящие в клеточных стенках под действием хитозана, могут являться причиной прекращения образования ростовых трубок и псевдогиф у клеток клинического изолята Candida albicans (рис. 2).

Важно отметить, что клетки микроорганизмов, находящиеся в контакте с хитозановым поликатионом, приобретают повышенную чувствительность к другим антибиотическим веществам за счет нарушения барьерной функции как клеточной стенки, так и ЦПМ [10, 11]. Таким образом, совместное применение хитозана и фунгицидных препаратов может стать одним из подходов к увеличению эффективности борьбы с заболеваниями, вызываемыми Candida albicans и другими грибами.

Видимые существенные изменения во внутриклеточном строении музейного штамма Candida albicans указывают на то, что хитозан затрагивает и биохимические процессы, происходящие внутри клеток грибов. Известно, что клетки дрожжей становятся гиперчувствительными к действию хитозана, если у них нарушен синтез и процессинг РНК, организация актинового цитоскелета, координация эндоцитоза [12]. Поэтому отрицательное воздействие хитозана на какой-либо из этих процессов может стать пусковым механизмом для уменьшения устойчивости клетки к хитозановому полимеру.

На основании литературных данных можно сделать вывод, что в отличие от классических веществ с антибиотическими свойствами, хитозан не имеет единственной мишени для своего действия, а его биоцидный эффект является совокупностью нескольких возможных механизмов, складывающихся в сложный процесс, который приводит в конечном итоге к гибели клеток микроорганизмов, таких как: изменение проницаемости ЦПМ, разрыв электрон-транспортной цепи, нарушение гликозилирования белков и другие [10, 13].

Заключение

Таким образом, показано, что музейный и клинический штаммы Candida albicans отличаются по своей чувствительности к низкомолекулярному хитозану. Хитозановый полимер по-разному воздействует на штаммы, вызывая существенные морфологические изменения клеток музейной культуры и ингибируя образование ростовых трубок и псевдогиф у клеток клинического изолята. Это указывает на обоснованность проведения дальнейших исследований по выяснению механизма действия полимера на молекулярном уровне с целью создания более эффективных подходов в борьбе с заболеваниями вызываемые Candida albicans и другими грибами.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 09-04-99035

С. Н. Куликов, С. А. Лисовская, Н. И. Глушко, А. Н. Левов, С. А. Лопатин, В. П. Варламов

Казанский НИИ Эпидемиологии и Микробиологии Роспотребнадзора

Центр «Биоинженерия» РАН, Москва

Куликов Сергей Николаевич — кандидат биологических наук, с.н.с. лаборатории иммунологии Казанского НИИ эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора

Литература:

1. Скрябин К.Г., Вихорева Г.А., Варламов В.П. Хитин и хитозан: получение, свойства и применение. М.: Изд-воНаука, 2002. с. 368.

2. Lim S.H., Hudson S.M. Review of chitosan and its derivatives as antimicrobial agents and their uses as textile chemicals. J. Macromol. Sci. 2003; v. C43: 2: 223 — 269.

3. Rabea E.I., Badawy M.E., Stevens C.V., et al. Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action. Biomacromol. 2003; v. 4: 6: 1457 — 1465.

4. Rhoades J., Roller S. Antimicrobial actions of degraded and native chitosan against spoilage organisms in laboratory media and foods. Appl. Environ. Microbiol. 2000; v. 66: 80 — 86.

5. Singla A.K., Chawla M. Chitosan: some pharmaceutical and biological aspects — an update. J. Pharm. Pharmacol. 2001; v. 53: 1047 — 1067.

6. Tharanathan R.N., Kittur F.S. Chitin — the undisputed biomolecule of great potential. Crit. Rev. Nutr. 2003; v. 43: 61 — 87.

7. Куликов С.Н., Тюрин Ю.А., Долбин Д.А., Хайруллин Р.З. Роль структуры в биологической активности хитозана. Вестник Казанского технологического университета 2007; 6: 10 — 15.

8. Лопатин С.А., Дербенева М.С., Куликов С.Н., и др. Фракционирование хитозана методом ультрафильтрации. Журнал Аналитической Химии 2009; т. 64: 3: 648 — 651.

9. Покровский В.И., Поздеев О.К. Медицинская микробиология. М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1999. с.1200 .

10. Zakrzewska A., Boorsma A., Brul S. et al. Transcriptional response of Saccharomyces cerevisiae to the plasma membrane-perturbing compound chitosan. Eukar. Cell. 2005; v. 4: 4: 703 — 715.

11. Liu H., Du Y., Wang X., Sun L. Chitosan kills bacteria through cell membrane damage. Int. J. Food Microbiol. 2004; v. 95: 147 — 155.

12. Zakrzewska A., Boorsma A., Delneri D. et al. Cellular processes and pathways that protect Saccharomyces cerevisiae cells against the plasma membrane-perturbing compound chitosan. Eukar. Cell. 2007; v. 6: 4: 600 — 608.

13. Raafat D., Bargen K., Haas A. et al. Insight into the mode of action of chitosan as an antibacterial compound. Appl. Env. Microbiol. 2008; v. 74: 1: 3764 — 3773.