Проведено иммунофенотипирование клеток кожного инфильтрата в  биопсированной коже участка манифестаций у 21 взрослого пациента с атопическим дерматитом с использованием проточной цитометрии и моноклональных антител. Получены новые данные  о морфологическом субстрате воспалительного клеточного инфильтрата, выявилена различия иммуноморфологического состава и функциональных характеристик дермальных лимфоцитов при различных вариантах течения.

Введение. Атопический дерматит (АД) остается важной медико-социальной проблемой, значимость которой определяется неуклонным ростом заболеваемости, его хроническим, рецидивирующим течением и сложностью в проведении терапии [1].  Исследователи отмечают многообразие клинических форм АД, при этом подчеркивают эволютивное возрастное развитие заболевания от эритематозных, везикулезно-крустозных в раннем возрасте к лихеноидным в старшие возрастные периоды [2, 3, 4]. Подчеркивая, таким образом, хронический характер течения АД, авторы ограничиваются констатацией состояния пациента на текущий момент, без сопоставления с предыдущими эпизодами обострений и без попыток прогноза течения процесса в дальнейшем. В работах Н.В. Кунгурова и соавторов (1998, 1999, 2000) установлены закономерности течения АД и наличие у большинства больных тенденции к преобладающему и повторяющемуся характеру клинических манифестаций процесса от обострения к обострению [5]. В результате длительного клинико-лабораторного мониторинга у большинства больных АД были установлены тенденции к преобладающему и повторяющемуся характеру клинических манифестаций процесса от обострения к обострению. Данные, полученные при изучении анамнеза заболевания, особенностей клинических проявлений дерматоза и их возрастной динамики, перенесенных заболеваний, причин обострений кожного процесса, структурированные и проанализированные при помощи компьютерных технологий,  позволили  среди всех больных АД, выделить три группы пациентов по варианту течения процесса, которые,  исходя из варианта реагирования и патогенетических особенностей, условно были названы: гиперергический  (у 29,5%) — ГВТ, инфекционный (у 30,5%) — ИВТ, пролиферативный (у 10,0%) — ПВТ. У части пациентов (около 30,0%) вариант течения был неуточнен, так как сочетал признаки перечисленных выше. Концептуальный подход к выделению клинико-лабораторных вариантов течения АД  представлен в исследованиях Ю.В. Сергеева и соавторов (2002), установивших гетерогенность течения АД на основании различных механизмов формирования иммунного ответа [2].

Основой для понимания локального аспекта патогенеза АД является положение о развитии в коже воспаления, опосредованного в основном активированными Т-лимфоцитами хелперами/индукторами второго порядка (Th2 — лимфоциты) с участием  антигенпрезентирующих  клеткок  (клетки Лангерганса), макрофагов, эозинофилов, нейтрофилов и других иммунокомпетентых клеток  [6,7, 8].

Анализ публикаций, освещающих иммунные механизмы развития АД «in situ», показывает, что большинство авторов рассматривают и сопоставляют две возможные клинические ситуации АД — острую и хроническую его фазы [6, 7, 8, 9, 10]. В то же время, остаются неизученными особенности клеточного состава, микроморфологии и иммуноморфологической характеристики лимфоцитов, формирующих дермальный инфильтрат при других клинико-морфологических формах заболевания, при различных вариантах течения АД.

Материалы и методы. С целью изучения патогенетических особенностей выявленных иммунных нарушений на локальном уровне нами впервые проведено иммунофенотипирование клеток кожного инфильтрата в нативной биопсированной коже участка манифестаций у 21 взрослого пациента с использованием проточной цитометрии и моноклональных антител: CD1a, CD3, CD4, CD8, CD19, CD15, RIL — 4, CD95, Ki67, TCRαβ,  TCRγδ первично меченных FITC или PE (Dako) в одно- и двухлучевой цитометрии на FACScan (Becton Dickincon, Германия).

Результаты и обсуждение. Результаты фенотипических исследований  приведены в таблице 1.

Таблица   1.

Состав клеточного инфильтрата кожи у больных с различными типами течения АД ( %,  абс. кол-во клеток)

		CD3+	CD4+	CD8+	CD19+	CD15+	CD1a+
ГВТ n=8	%	64,06±5,4	45,85±6,9	14,57±4,9	15,43±2,2	3,27±0,6	8,1±1,1
	Абс.	292,4±61,0	132,1±21,8	65,3±10,4	69,8±6,1	16,3±1,9	35,4±4,1
ИВТ n=5	%	44,71±4,8	23,67±6,3	36,6±2,4	7,43±1,4	11,5±1,6	4,63±2,2
	Абс.	127,2±54,2	80,9±15,0	105,9±12,8	20,3±3,0	33,7±6,6	13,0±1,7
ПВТ n=8	%	68,63±6,7	51,6±4,8	19,1±3,5	8,5±1,7	2,6±0,5	5,13±0,9
	Абс.	336,7±43,9	276,2±41,0	99,1±9,6	45,3±7,2	13,1±1,8	25,7±1,9
р*		р1, р3	р1, р2, р3	р1, р3	р1, р2, р3	р1, р3	р1, р2 р3

р* — значение р<0,05; где р₁ — при сравнении показателей  ГВТ и ИВТ; р₂— при сравнении показателей ГВТ и ПВТ; р₃— при сравнении ИВТ и ПВТ.

При исследовании общей клеточности инфильтрата кожи установлены максимальные значения показателя у больных с ПВТ (503,7±74,6 клеток), т.е. достоверно более высокая численность маркированных клеточных элементов кожи, в сравнении с ИВТ. На втором месте по числу извлеченных из гомогената кожи клеток находился ГВТ (435,3±58,3), где клеточность инфильтрата была также достоверно высокой, чем при ИВТ (281,9±42,5 клеток). Общее содержание CD3+ клеток, представляющих  Т — популяцию дермальных лимфоцитов, колебалось от  44,71±4,8% (127,2±54,20 клеток) — при ИВТ до 68,63±6,7% (336,7±43,9 клеток) — при ПВТ. Пролиферативный и гиперергический варианты течения дерматоза демонстрировали, таким образом, достоверно более выраженную клеточность лимфоцитарного инфильтрата, состоящего из Т-лимфоцитов.

При рассмотрении субпопуляционного состава клеточного инфильтрата в коже  у больных с различными вариантами клинического течения АД выявлено, что средние значения содержания CD4+ лимфоцитов  в коже значительно отличались. Так, в группе больных с ГВТ среднее содержание CD4+ лимфоцитов составило 45,85±6,9% (132,1±21,8 клеток), у больных с ИВТ — 23,67±6,3% (80,9±15,0 клеток), а у пациентов с ПВТ — 51,6±4,8% (276,2±41,0 клеток). Численность CD4+ лимфоцитов, принадлежащих к субпопуляции лимфоцитов хелперов/индукторов, была достоверно более высокой у больных  с ПВТ, по сравнению с ИВТ и ГВТ, а  в коже группы больных с ГВТ достоверно превышала таковую в группе с  ИВТ дерматоза.

Относительное и абсолютное количество CD8+ лимфоцитов в коже также достоверно различалось у больных с различными вариантами течения АД, причем было максимальным  в группе пациентов с ИВТ (36,6±2,4% и 105,9±12,8 клеток), более низким у больных с ГВТ (14,57±4,9% и 65,3±10,4 клеток) и ПВТ (19,1±3,5% и 99,1±9,6 клеток).

Содержание CD19+ лимфоцитов, в процентном и абсолютном значении, было наиболее высоким у лиц с ГВТ (15,43±2,2% и 69,8±6,1 клеток), превышая таковое в коже у больных с ИВТ в 2,0 раза, а у больных с  ПВТ в 1,8 раза.

Исследования обнаружили также достоверные различия в абсолютном содержании CD1a+ клеток при различных вариантах течения АД. Наибольшее число CD1a+ клеток, относящихся к разряду дендритных клеток Лангерганса, было выявлено в коже больных группы ГВТ процесса (8,1±1,1 % и 35,4±4,1 клеток). На втором месте — абсолютное содержание CD1a+ клеток в  коже больных с ПВТ (5,13±0,9 % и 25,7±1,9), и минимальное их количество выявлялось в коже больных с ИВТ — 4,63±2,2 % и 13,0±1,7 клеток.

Относительные и абсолютные показатели содержания CD15+ клеток, идентифицируемых как гранулоциты, отличались наиболее высокими значениями в группе больных с ИВТ, составляя  11,5±1,6% и 33,7±6,6 клеток, что в 3,5 раза больше, чем в группе больных с ГВТ и в 4,4 раза больше, чем в коже  у больных с ПВТ.

В коже у больных с ГВТ АД превалировали Т-лимфоциты, около половины которых составляли Т- лимфоциты хелперно/индукторной субпопуляции с умеренным представительством Т- лимфоцитов супрессоров.  В составе инфильтрата  достоверно в большем количестве, чем при 2 других вариантах,  были представлены клетки Лангерганса и В — лимфоциты. В группе пациентов с ИВТ содержание Т- лимфоцитов было в 1,4 раза меньшим, чем при ГВТ, а в субпопуляционном составе превалировали Т- лимфоциты супрессорно/цитотоксического вида. Содержание В- лимфоцитов в коже больных этой группы было незначительным; отмечалось максимальное из всех исследованных групп присутствие гранулоцитов, клеток эффекторов микробного воспаления.

Кожа больных с ПВТ характеризовалась максимальной выраженностью общего числа клеток (клеточность инфильтрации), представленных подавляющим количеством Т-лимфоцитов, половина которых относилась к субпопуляции Т-хелперов. Было отмечено умеренное  представительство Т-супрессоров, клеток Лангерганса и минимальное — В лимфоцитов и гранулоцитов.

В таблице 2 показаны соотношения основных клеточных популяций, представленных в коже больных различных групп.

Таблица   2.

Соотношение клеточных популяций (абс.) в коже больных с различными типами течения атопического дерматита

	CD19+/CD3+	CD4+/CD8+	CD15+/CD3+	CD1a+/CD3+	CD1a+/CD4+
ГВТ	0,24±0,05	2,03±0,25	0,06±0,01	0,12±0,01	0,27±0,05
ИВТ	0,17±0,01	0,76±0,1	0,26±0,06	0,1±0,02	0,16±0,02
ПВТ	0,12±0,03	2,79±0,18	0,04±0,01	0,07±0,01	0,09±0,01
р*	р2	р1, р2, р3	р1, р3	р2,	р2, р3

р* — значение р<0,05; где р₁ — при сравнении показателей  ГВТ и ИВТ; р₂— при сравнении показателей ГВТ и ПВТ; р₃— при сравнении ИВТ и ПВТ.

Приведенные в таблице 2 данные свидетельствуют об имеющихся различиях в соотношении клеточных популяций при различных вариантах течения АД. Так, ГВТ дерматоза, клинически представленный преобладанием гиперемии, отечности кожи, морфологически характеризовался большим представительством В-лимфоцитов и клеток Лангерганса, опосредующих гуморальный компартмент локального воспалительного процесса и антигенпрезентирующий механизм. В то же время, пролиферативные проявления,  со стойкой инфильтрацией кожи и лихенификацией, характеризовались подавляющим представительством Т-лимфоцитов хелперов/индукторов с недостаточной численностью Т лимфоцитов — супрессорно-цитотоксической субпопуляции. ИВТ закономерно был представлен большим числом гранулоцитов в коже и менее выраженной клеточной инфильтрацией Т-хелперами.

В целях оценки функциональной активности  клеток,  составляющих субстрат инфильтрата кожи, проведено фенотипирование с использованием набора моноклональных антител RIL — 4+, CD95+, Ki67+, TCRαβ+,  TCRγδ+, результаты которого представлены в таблице 3.

Таблица   3.

Детекция  функциональных рецепторов клеток  кожи у больных с различными вариантами течения атопического дерматита

Вариант течения		TCRαβ+	TCRγδ+	CD95+	Ki 67+	RIL — 4+
ГВТ	%	20,8±3,2	13,9±2,4	0,6±0,08	7,25±1,0	11,03±2,1
	Абс.	90,5±19,2	60,6±13,1	2,7±0,9	32,1±3,9	47,9±7,8
ИВТ	%	28,5±1,9	4,6±0,9	0,23±0,04	11,93±1,6	19,88±3,4
	Абс.	80,1±7,7	12,9±2,4	1,0±0,2	33,5±3,5	55,9±6,3
ПВТ	%	40,38±5,5	8,9±1,7	0,66±0,1	20,67±3,0	26,15±4,3
	Абс.	203,5±43,6	44,8±7,1	3,4±0,9	104,1±14,5	131,8±20,2
р* р**		р**2 р**3 р2 р3	р**1 р**3 р1 р3	р**1 р**3 р1 р3	Р**1 р**2 р**3 р2 р3	Р**1 Р**2 р2 р3

р* — значение р<0,05; где р₁ — при сравнении абсолютных показателей  ГВТ и ИВТ; р₂— при сравнении показателей ГВТ и ПВТ; р₃— при сравнении ИВТ и ПВТ; р** — при сравнении относительных показателей.

Из данных таблицы 3 видно, что в составе клеточного инфильтрата кожи у больных АД при всех вариантах течения относительное и абсолютное содержание лимфоцитов, несущих на своей поверхности TCRαβ+ рецептор,  превышало число TCRγδ+ лимфоцитов. Данный факт свидетельствовал о том, что основная масса инфильтрирующих кожу лимфоцитов являлась рекрутированной из кровеносного русла. Наибольшая относительная и абсолютная численность TCRαβ+ лимфоцитов была выявлена у больных с ПВТ, в коже которых данный показатель высоко и положительно коррелировал с числом Т-лимфоцитов хелперно/индукторной субпопуляции. Относительное количество лимфоцитов, экспрессирующих TCRγδ+ и считающихся резидентными для эпидермиса и дермы, колебались от 4,6±0,9% до 13,9±2,4%, что не противоречило положению о принадлежности около 10,0% всех локально функционирующих в коже лимфоцитов именно к этому типу. Среди изученных клеток гомогената кожи наибольшая экспрессия рецептора к интерлейкину — 4 (RIL-4) была выявлена на клетках в группе больных с ПВТ, (26,15±4,3% и 131,8±20,2 клеток), что в 2,8 раза превышало показатель у больных с ГВТ и в 2,4 раза — у больных в группе с ИВТ АД.

Среди всех экстрагированных клеток гомогената кожи от 7,25±1,0% до 20,67±3,0% (32,1±3,9 и 104,1±14,5 клеток соответственно) демонстрировали экспрессию внутриклеточного рецептора к МКА Ki67, характеризующего пролиферативную активность. Наибольшее число таких клеток было обнаружено в коже группы больных с ПВТ (20,67±3,0% и 104,1±14,5 клеток), тогда как при ГВТ их было в 3,2 раза, а при ИВТ — в 3,1 раза меньше. Учитывая умеренную отрицательную корреляцию данного показателя с численностью CD4+  и TCRαβ+ лимфоцитов в коже, а также наличие данного рецептора в ядрах других клеток, возможно предположить проявление Ki67 — позитивности не только дермальными лимфоцитами, но и эпидермоцитами из исследованных образцов кожи больных с ПВТ дерматоза. Доля лимфоцитов, экспрессирующих рецептор к CD95 (Fas/APO-1), определяющий готовность клеток к апоптозу, была незначительна при всех вариантах течения АД, однако в коже пациентов с ПВТ и ГВТ таких клеток выявлялось достоверно больше, чем при ИВТ заболевания. Количество Fas — позитивных лимфоцитов умеренно коррелировало (r=0,64) с показателем Ki67+ клеток при ГВТ и крайне высоко (r=0,95) при ПВТ. Данный феномен свидетельствует о возможной готовности к апоптозу  путем экспрессии Fas/APO-1 рецептора на лимфоцитах именно Ki67+ пула.

Из числа других значимых корреляций   обращает на себя крайне высокая отрицательная зависимость между CD4+ и CD8+ лимфоцитами, которая фиксировалась при всех вариантах течения — ГВТ, ИВТ, ПВТ (r=- 0,96; -0,95; — 0,83). Отмечалась также выраженная отрицательная корреляция между содержанием CD8+ лимфоцитов и числом клеток, экспрессирующих RIL-4 при всех вариантах течения АД (r= — 0,74; — 0,71; — 0,88). Данные  факты соотносятся с положением о преобладающей патогенетической роли дермальных Т-лимфоцитов хелперно/индукторной субпопуляции и ослаблении функциональной активности лимфоцитов супрессоров.

Заключение

Таким образом, установлены следующие иммуноморфологические и функциональные  особенности клеточного инфильтрата дермы при различных вариантах течения АД:

у больных с ГВТ присутствовали Т-лимфоциты хелперно/индукторной субпопуляции  в сочетании со значительным представительством (15,43±2,2%) В-лимфоцитов и дермальных дендритных клеток (CD1а — 8,1±1,1%);

в коже больных с  ИВТ содержание Т- лимфоцитов было в 1,4 раза меньшим, чем при ГВТ, отмечалось превалирование Т-лимфоцитов супрессорно/цитотоксической субпопуляции и максимальное среди других типов значимое представительство гранулоцитов;

инфильтрат в коже у больных с ПВТ характеризовался высокой клеточностью, состоял из  активированных Т-лимфоцитов  в 20,67±3,0%  позитивных к МКА Ki67+, с максимальной из всех типов готовностью к апоптозу.

Полученные новые научные данные, уточняющие иммуно-опосредованные механизмы формирования кожного патологического процесса при АД, позволят предложить иммунологические критерии обоснования выбора терапии.

Ю.В. Кениксфест, Н.В. Кунгуров, М.М. Кохан, С.В. Сазонов

Уральский научно- исследовательский институт дерматовенерологии и иммунопатологии

Уральская государственная медицинская академия

Кениксфест Юлия Владимировна — Старший научный сотрудник, кандидат медицинских наук

Кунгуров Николай Васильевич — Директор, профессор, доктор медицинских наук

Кохан Муза Михайловна — Руководитель научного клинического отдела, профессор, доктор медицинских наук

Сазонов Сергей Владимирович — Заведующий кафедрой гистологии, доктор медицинских наук.

Литература:

1.  Российский национальный согласительный документ по атопическому дерматиту (под общ. Ред. Р.М. Хаитова и А.А. Кубановой): Атопический дерматит: наружная терапия. -М.: «Фармарус Принт», 2002. -68 с.

2.  Сергеев Ю.В., Иванов О.Л., Новиков Д.К. Атопический дерматит: современная диагностика и лечение //  Иммунопатология, аллергология, инфектология. -2001. -№4. -С.   28-48

3.  Суворова К.Н. Атопический дерматит: иммунопатогенез и стратегия иммунотерапии/ К. Н. Суворова//  Русский медицинский журнал.

4.  Торопова Н. П. Экзема и нейродермит у детей (Современные представления о патогенезе, клинике, лечении и про¬филактике)/ Н. П. Торопова, О. В. Синявская.  -Екатеринбург, 1993. -276 с.

5.  Кунгуров Н.В., Герасимова Н.М., Кохан М.М. Атопический дерматит (типы течения, принципы терапии) ,- Екатеринбург: изда-во Урал. ун-та, 2000.-266 с.

6.  Leung D.Y.M.. Atopic dermatitis/ D. Y. M. Leung,  T. Bierber// Lancet. — 2003. — Vol.  361. — P. 151-160

7.  Leung, D. Y. M. Characterization of the mononuclear cell infiltrate in atopic dermatitis using monoclonal antibodies/ D. Y. M. Leung, A. K. Bhan, E. E. Schneeberger, R. S. Geha //J. Allergy Clin. Immunol. — 1989. — Vol.  71. — P. 47.

8.  Romagnani S. The role of lymphocytes in allergic disease/ S. Romagnani//  J. Allergy Clin. Immunol. —  2000. — Vol. 105. — P.  399-408

9.  Bieber T.  Atopic dermatitis/ T. Bieber, D.Y.M. Leung. — New York: Marcel Dekker, 2002. — P. 401 — 418.

10. Wollenberg A. Topical tacrolimus (FK506) leads to profound phenotypic and functional alterations of epidermal antigen-presenting dendritic cells in atopic dermatitis/ A. Wollenberg [et al]//  J. Allergy Clin. Immunol. — 2001. — Vol. 107. — P.  519-25.